Kisspeptinse yon ti peptide molekil ki konpoze de 54 résidus asid amine ak yon pwa molekilè apeprè 6000 Dalton. Se sekans asid amine li trè konsève nan mamifè, ki vle di li gen estrikti ki sanble nan diferan espès. Nan imen, sekans asid amine Kisspeptin se H-Phe Gly Gly Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Arg Arg Al Glu Leu Ser Eu Ser Arg Al Glu Eu Ser Arg. Kiss1 jèn kode, jèn sa a premye transkri nan yon précurseur pwoteyin Kiss1, ki sibi yon seri de pwosesis ak splicing finalman fòme Kisspeptin ki gen matirite. Degradasyon Kisspeptin se sitou te pote soti nan peptidaz, ki kraze li an pi piti fragman oswa asid amine endividyèl. Jwe yon wòl enpòtan nan sistèm repwodiktif la. Li konsidere kòm yon enpòtan gonadotropin divilge òmòn (GnRH) faktè divilge ki ka ankouraje liberasyon an nan gonadotropin, kidonk ankouraje spirasyon ak ovilasyon nan selil jèm yo. Anplis de sa, Kisspeptin patisipe tou nan reglemante lòt pwosesis fizyolojik, tankou emosyon, memwa, ak fonksyon mantal.
Kisspeptin peptide, ke yo rele tou Kiss1 peptide oswa RFRP-1 peptide, se yon neuropeptide yo jwenn nan kò imen an. Nan laboratwa a, yo souvan itilize metòd sentèz sa yo pou sentèz Kisspeptin:
sentèz chimik:
Sentèz chimik se metòd ki pi souvan itilize pou sentèz Kisspeptin nan laboratwa a. Metòd sa a gen ladan plizyè reyaksyon chimik, tankou kondansasyon, depwoteksyon, ak desalination. Pami yo, etap kle a se fòmasyon lyezon peptide ant asid amine, anjeneral lè l sèvi avèk ajan kouple klasik tankou EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) - carbodiimide) oswa BOP ( benzotriazol-1-yl-oxy-tris (dimethylamino) fosfonyòm ègzafluorofosfat). Avantaj nan sentèz chimik se ke li ka jwenn Kisspeptin-wo pite, men dezavantaj nan metòd sa a se ke li mande pou etap eksperimantal ankonbran ak kondisyon laboratwa strik, pandan y ap sede a ba.
Etap reyaksyon espesifik yo se jan sa a:
1. Prepare materyèl kòmanse. Sa a gen ladan asid amine ki nesesè yo, aktivatè (tankou EDC oswa BOP), reyaktif depwoteksyon (tankou asid trifluoroacetic oswa asid idrobromik), osi byen ke lòt reyaktif ki nesesè yo ak solisyon tanpon.
2. Anba kondisyon anidrid ak oksijèn gratis, fonn asid amine ki nesesè yo nan solvang apwopriye tankou dimethylformamide (DMF) oswa N, N-dimethylacetamide (DMA).
3. Ajoute activateur ki nesesè yo (tankou EDC oswa BOP) epi brase nan tanperati chanm pou yon sèten tan pou fòme lyezon peptide.
4. Ajoute reyaktif deprotective (tankou asid trifluoroacetic oswa asid idrobromik) nan lyezon peptide ki fòme yo pou retire gwoup pwoteksyon amine.
5. Ajoute gwoup pwoteksyon ki nesesè yo (tankou Boc oswa Fmoc) pou pwoteje gwoup amine ki fèk fòme yo.
6. Repete etap ki anwo yo jiskaske tout asid amine ki nesesè yo te konekte.
7. Ajoute modifikasyon chèn bò ki nesesè yo ak/oswa makè nan chèn peptide a.
8. Finalman, yo te fè yon reyaksyon depwoteksyon pou retire tout gwoup pwoteksyon epi jwenn Kisspeptin pirifye.
Pi wo a se yon metòd sentèz chimik debaz, ak etap espesifik yo ka varye selon sekans espesifik Kisspeptin ak modifikasyon ki nesesè yo. Pandan tout pwosesis sentèz la, li nesesè estrikteman kontwole kondisyon eksperimantal yo, ki gen ladan sòlvan, tanperati, pH, tan, ak presyon, asire pwogrè nan lis nan reyaksyon an ak pite a segondè nan pwodwi a. An menm tan an, li nesesè yo peye atansyon sou sekirite nan reyaksyon chimik epi evite itilize nan reyaktif danjere ak operasyon.
Jeni jenetik sentèz:
Jenetik Jeni sentèz se yon metòd efikas, rapid ak ekonomik pou sentèz Kisspeptin. Metòd sa a sèvi ak teknoloji jeni jenetik pou eksprime pwoteyin précurseur Kisspeptin nan mikwo-òganis tankou Escherichia coli oswa ledven, ak Lè sa a, sibi post-pwosesis pou jwenn Kisspeptin ki gen matirite.
Sa ki anba la a se yon pwosesis senplifye:
1. Klonaj jèn: Premyerman, li nesesè pou jwenn sekans jèn Kisspeptin. Sa a ka jwenn nan tisi byolojik atravè RT PCR, sekans genomic, oswa lòt teknik klonaj jèn.
2. Seleksyon vektè: Apre sa, ou bezwen chwazi yon vektè pou mete sekans jèn Kisspeptin. Sa a se anjeneral yon plasmid bakteri inofansif oswa vektè viral. Vektè a fèt pou mete jèn Kisspeptin epi pote l nan selil la.
3. Transfòmasyon jèn: Mete jèn Kisspeptin nan yon vektè, epi transfere konplèks sa a (jèn + vektè) nan bakteri jeni tankou Escherichia coli oswa ledven.
4. Ekspresyon: Nan bakteri jeni, jèn Kisspeptin "li" epi li gide sentèz pwoteyin. Pwoteyin sa yo anjeneral tache ak etikèt chimik espesyal pou pwosesis pirifikasyon ki vin apre yo.
5. Post pwosesis: Pwoteyin précurseur Kisspeptin sa yo ki te pwodwi pa bakteri enjenyè yo ka kolekte epi pirifye atravè etap tankou fwagmantasyon selil, santrifujasyon, ak dyaliz.
Avantaj nan metòd sa a se ke li ka pwodwi yon gwo kantite Kisspeptin nan yon kout peryòd de tan, ak pri a se relativman ba. Anplis de sa, akòz itilizasyon mikwo-òganis, metòd pwodiksyon sa a gen yon enpak minim sou anviwònman an. Sepandan, dezavantaj nan metòd sa a se ke li mande pou manipilasyon nan mikwo-òganis ak Se poutèt sa mande pou sèten ekipman laboratwa ak ladrès.
Idroliz bioenzymatic:
Idwoliz bioenzymatic se yon metòd pou fè sentèz Kisspeptin lè l sèvi avèk kataliz anzim. Metòd sa a itilize anzim byolojik espesifik pou konvèti pwoteyin précurseurs Kisspeptin nan Kisspeptin ki gen matirite.
Etap debaz yo pou sentèz Kisspeptin atravè idroliz anzimatik byolojik:
1. Klonaj jèn ak seleksyon vektè: Premyerman, li toujou nesesè pou jwenn sekans jèn Kisspeptin, epi chwazi yon vektè pou mete li.
2. Ekspresyon: Mete jèn Kisspeptin nan vektè a, epi transfere konplèks sa a (jene + vektè) nan bakteri jeni an.
3. Pwoteyin sentèz: Nan bakteri jeni, jèn Kisspeptin "li" epi li gide sentèz pwoteyin. Pwoteyin sa yo anjeneral tache ak etikèt chimik espesyal.
4. Idroliz bioenzymatic: Itilizasyon pwoteaz espesifik, tankou subtilisin oswa tripsin, pou konvèti pwoteyin précurseurs nan Kisspeptin ki gen matirite. Anzim byolojik gen gwo espesifik ak efikasite katalitik, kidonk etap sa a nan reyaksyon ka ranpli byen vit ak efektivman.
5. Post pwosesis: Atravè yon seri etap tankou fwagmantasyon selil, santrifujasyon, dyaliz, elatriye, Kisspeptin finalman kolekte epi pirifye.
Avantaj nan metòd sa a se ke li ka ranpli sentèz la nan Kisspeptin nan yon ti tan. Se pa sèlman vitès sentèz la vit, men tou, efikasite katalitik nan anzim byolojik trè wo, sa ki ka amelyore anpil sede pwoteyin sib yo. Pandan se tan, anzim byolojik yo itilize nan idroliz anzimatik souvan gen gwo spesifik epi yo ka byen ak efikasite fonksyone nan molekil byolojik konplèks. Se poutèt sa, metòd sa a se zanmitay anviwònman an e li gen ti enpak sou estrikti a ak fonksyon nan pwoteyin sib la. Sepandan, metòd sa a tou gen sèten limit, tankou difikilte nan jwenn ak prepare anzim byolojik, gwo depans, ak bezwen pou kontwòl egzak nan kondisyon reyaksyon.
Kilti selilè:
Kilti selil se yon metòd pou fè sentèz Kisspeptin nan laboratwa a. Metòd sa a enplike kiltive yon liy selilè ki gen sekans jèn Kisspeptin, ak Lè sa a, kolekte Kisspeptin ki sekrete nan mwayen kilti a. Espesyalman, se sekans jèn Kisspeptin premye antre nan liy selil la, ki te swiv pa kilti selil ak optimize kondisyon. Finalman, Kisspeptin yo kolekte nan mwayen kilti a. Avantaj nan kilti selil se ke li ka pwodwi yon gwo kantite Kisspeptin, ak operasyon an nan metòd sa a se relativman senp.
An rezime, gen divès metòd pou fè sentèz Kisspeptin nan laboratwa a, epi chak metòd gen pwòp avantaj ak dezavantaj li yo. Metòd apwopriye yo ka chwazi pou sentèz selon bezwen aktyèl yo. Pami yo, sentèz chimik ak sentèz jeni jenetik yo se metòd ki pi souvan itilize, pandan y ap idwoliz anzimatik ak kilti selil yo se lòt opsyon posib.